柱层析硅胶的加入
方法有干法和湿法两种，下面具体介绍柱层析硅胶操作方法。
①干法:将硅胶一次加入色谱柱，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱柱下端出口加活塞，加入适量的流动相，旋开活塞使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入硅胶，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的流动相留在硅胶的上面。
②湿法:将硅胶与流动相混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后再加入流动相，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整。填装硅胶所用流动相从色谱柱自然流下，液面将柱表面相平时，即加试样溶液.
2.3.2上样
将试样溶于层析时使用的流动相中，再沿色谱柱壁缓缓加入。注意勿使硅胶翻起。或将试样溶于适当的溶剂中。与少量硅胶混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状;将混有试样的硅胶加在已制备好的色谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解，可将试样与适量的硅胶在乳钵中研磨混匀后加入。
2.4洗脱与收集
除另有规定外，通常按流动相洗脱能力大小，递增变换流动相的品种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的流动相留在硅胶的上面。
2.5样品分离后的检测
2.5.1初步检测
当冲洗溶剂流出一定量后，可对流出液进行初步检测，并且将锥形瓶更换成小试管进行收集.一般只进行初步的快捷检测,因此通常是取薄层板,用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块,并按照一定的次序编号取一根内径为0.3mm左右的玻璃毛细管蘸取少量流出液，点于薄层板的一个小格内，待半点干后,然后用物理的或化学的方法检测.
2.5.2正式检测
①点样:取分部收集的冲洗溶液进行分别直接点样，如果冲洗溶液太稀,浓度太小，可先浓缩.点样的容器一般用玻璃毛细管,点样斑点的直径一般为3-5mm。
②展开:在普通的展开槽中进行,展开方式常选用上行展开。
③展开剂:实用冲洗溶液。
④显色:般常用物理检测法和化学检测法。物理检测法中首先有紫外光法,紫外光常用两种波长(254nm与365nm)，其次是碘蒸气显色法。化学检出法通常用显色剂直接喷雾，显色剂有通用显色剂和专用显色剂，通用显色剂最常见的是硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液,喷雾后,有的化合物立即反应，但多数化合物需加热后经历数分钟才显色,不同化合物的反应不同，所以颜色也往往不同。专用显色剂是指对某个或某一类化合物显色的试剂,利用化合物本身的特有性质,或利用其所含的某些官能团的特殊反应展开后根据斑点的，可以粗略的估计待分离物的含量的大小。
2.6合并处理
根据上面薄层板检测的结果,我们可以将具有相同Rf值的部分进行合并，然后利用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸发，最后得到我们需要的目标产物。
2.7色谱柱的洗涤
在绝大多数情况下,层析柱中的硅胶是一次性使用,但在使用后的色谱柱中由于还含有冲洗溶剂，所以要将里面的硅胶到出是比较困难的，取出硅胶的一种方法是将该柱管放置一段时间，让溶剂自然挥发完后,倒出硅胶。但这种方法既费时又污染环境。第二种方法可以用一根比色谱柱稍长的木杆或塑料杆将含有溶剂的硅胶一段一段地掏出，但这种办法也比较麻烦。第三种方法是利用一个一般的真空泵，经色谱柱中剩余的溶剂进行减压抽出，在色谱柱和真空泵之间加一个冷阱，这样抽出的溶剂既进行了有效地收集而不污染环境,而色谱柱中的硅胶又能较快得到干燥，使硅胶能够方便地倒出。
3.色谱柱的选择
常用的柱子可以分为:加压,常压,减压。
压力可以增加溶剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
①减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结)，以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音，而且时间长)。
②加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使溶剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
③常压柱色谱，是色谱法中最常见的一种。它的突出优点是，分离效率比经典的化学分离方法高的多，与其他色谱法相比，不需要昂贵的仪器设备，更换流动相和吸附剂方便，消耗材料少，成本低，适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品，因此在化学实验室中至今仍被广泛应用。
