柱层析硅胶分离天然产物实验要点分析

     从天然产物中提取、分离和表征生物小分子,是新药研发中获得先导化合物的主要途径之一。层析法(Chromatography)是天然产物分离最常用的方法之一。层析法最早是根据化合物颜色分离一些植物色素,如今,层析法已经演变成为一种高度敏感的、有效的化合物分离和鉴定方法。

     柱层析一般包括常压柱层析、中压柱层析和高压柱层析。按照柱填料又可分为柱层析硅胶、离子交换层析、凝胶渗透色谱、疏水作用色谱等,其中以柱层析硅胶(正/反相)使用最为广泛。与其他层析方法相比,柱层析具有操作简单,经济实惠,样品承载量大等优点,是天然产物分离纯化的方法之一。

     柱层析硅胶分为正相硅胶柱层析和反向硅胶柱层析2种,正相硅胶柱层析填料为正相硅胶,适合分离相对极性较小的化合物,例如各类苷元;所以通常选用极性较小的有机溶剂作为洗脱剂,例如石油醚-二氯甲烷洗脱系统,氯仿-乙酸乙酯洗脱系统等。反向硅胶柱层析使用的是反相硅胶,适合分离极性相对较大的化合物,例如生物碱等各类苷类,常采用甲醇-水,乙腈-水不同比例作为洗脱剂。柱层析硅胶在上样时,常分为干法上样和湿法上样。

     干法上样将待分离物质溶解后拌在少量硅胶G中,待挥发至干后填入装好的硅胶柱中,再加层析液进行洗脱。湿法上样先将硅胶G用洗脱液溶胀后装入硅胶柱,再将溶解好的样品倒入硅胶柱进行分离。这2种方法对物质分离效果差别不大,湿法上样操作简单便捷,但溶解样品用二氯甲烷、乙酸乙酯等极性较小的溶剂,对于一些溶解度小的物质,宜使用干法上样。

     本文以常压正相硅胶柱的干法上样为例,对小孢拟盘多毛孢红薯渣发酵产物二氯甲烷粗提物进行初步分离。1材料和方法1.1实验材料二氯甲烷相粗提物约1 g;100~200目硅胶G约100 g;内径×柱高=2.5 cm×40 cm玻璃柱;Si60 F254 TLC薄层层析板(默克化工技术有限公司);0.3 mm毛细管。10%硫酸乙醇显色液;二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇。

     1.2层析液比例确定由于TLC法操作简单,且层析原理与柱层析硅胶一致,所以确定硅胶柱层析层析条件时一般用TLC探索条件。
     TLC法分为正相TLC和反向TLC 2种。由于柱层析硅胶可以近似地看作TLC板多次展开系统,样品洗脱速率要比TLC板上展开速率快,所以一般选用Rf值为0.3~0.5的层析液进行硅胶柱层析。具体操作方法如下:1)用玻璃刀将现成的TLC板裁成2 cm×8 cm左右小板,用毛细管将稀释后适当浓度的粗提物样品点在离TLC板短边缘1 cm处正中央。注意样品点尽可能小,可及时用吹风机冷风吹干。
     2)选择二氯甲烷∶乙酸乙酯=1∶0,9∶1,1∶1和0∶1对样品进行TLC展开,待层析液跑至上边缘0.5 cm处停止展开,用吹风机吹干硅胶板上的有机试剂。
     3)将展开好的TLC板用硫酸乙醇液显色后观察,目标物质的Rf值分别为0.15,0.5,0.8和0.9,选取Rf=0.3-0.5的层析液作为柱层析硅胶的层析液,所以选择二氯甲烷∶乙酸乙酯=9∶1为柱层析层析液。