总结柱层析硅胶的实际应用

色谱法，也叫层析。是一种以分配平衡为机制的分配方法，色谱系统包括两个相，一个是固定相，一个是流动相。在两相相对运动时，反复多次地利用混合物中所含各组分配平衡性质的差异，达到相互分离的目的。主要用于提纯、分离有机或无机物质。
在实验室和实践中，色谱法按照固定相分分为柱色谱、平板色谱和棒色谱三种类型，而在实验室和实践中常用的有柱层析硅胶和薄层硅板，以及它们之间的配合应用。
1.吸附色谱原理。
硅胶与所分离物质在一定条件下发生作用，主要是物理和化学作用，其中两种物理作用来源于硅胶表面与溶质分子之间的范德华力，化学作用主要是硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢键作用。
2.硅胶柱色谱的实用应用
具体操作步骤请以实验室为例：
2.1制备硅树脂。
为200-300目规格准备一定量的柱色谱色谱。
2.2试验设备的准备。
一根玻璃色谱柱，一铁台子，烧杯，锥形瓶，直径较大的玻璃漏斗，一根玻璃棒。
2.3装柱
2.3.1添加柱色谱硅胶。
采用的方法有干法和湿法，下面具体介绍使用方法。
①干法：将硅胶一次性加到色谱柱中，振荡管壁使之均匀沉降，然后慢慢加入到层析开始所用的流动相，或者在色谱柱下端出口加活塞，加入适当的流动相，旋开活塞，使流动相慢慢滴出，然后从管顶慢慢注入硅胶，将其均匀浸润下沉，在管内形成一个松而适度的吸附层。在运行时，应使硅胶表面保持足够的流动性。
②湿法：将硅胶与流动相混合，搅拌除去气泡，然后向色谱柱倾斜，然后加入流动相，洗脱附在管壁上的吸附剂洗脱，使色谱柱平整。填充硅胶所用的流动相从色谱柱自然流出来，在液面使该柱面相常，即加试样溶液.
2.3.2上样。
用来溶解样品的流动相，然后慢慢地在色谱柱上加入样品。小心不要把硅胶倒出来。或者把样品溶解在合适的溶剂里。和少量硅胶混合，再使溶剂挥发去尽，使样品变得松散；硅胶混合样品加入到制备好的色谱柱上。当样品在普通溶剂中不溶解时，将样品和适量的硅胶在乳钵中研磨混合，然后加入。
2.4洗涤和收集。
除非另有说明，一般情况下，流动相的种类和比例按照流动相洗脱能力大小递增变化，分别分收集流出液，当流出液中所含成分明显减少或不再包含时，再改变流动相的品种和比例。在运行时，应使硅胶表面保持足够的流动性。
2.5分离后的样品检测。
2.5.1初步检验。
在冲洗溶剂流出一定量后，对可对流出液进行初步检测，并把锥形瓶替换为小试管以收集.通常仅能快速地初步测试，所以通常是取薄层板，使用铅笔和尺子把硅胶板分成许多小方，并且按一定的顺序编号取一根内径0.3mm左右的玻璃毛细管蘸取少量流出液，点在薄层板的一个小格子内，等一半干燥后，再进行物理或化学测试。
2.5.2正式测试
①点样法：将分部收集的冲洗液分别直接点样，若冲洗液溶液过稀、浓度过低，可以先浓缩，点样容器一般采用玻璃毛细管，点样斑点直径一般在3-5mm。
②展开：在普通展开槽中进行，展开方式通常选择向上展开。
③展开剂：实用的冲洗液。
④显色：就是一般的物理检测方法和化学检测方法。在物理检测中，通常采用的是紫外方法，通常采用两种波长(254nm和365nm)，其次是碘蒸汽显色。化验方法一般是直接使用显色剂，显色剂采用通用显色剂和专用显色剂，一般的显色剂通常用硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液，有一些化合物在喷雾后立即发生反应。但是大多数化合物需要加热几分钟才能显色，不同化合物的反应不同，因此颜色也往往会有所不同。专有的显色剂是指试剂，将一种或一类化合物显色，或利用该化合物中含有的某些官能团的特殊反应展开后，根据该物质中点点的情况，大致估算出待分离物含量的大小。
2.6合并处理
基于上述薄层板检测的结果，可将具有相同Rf值的零件合并，再用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸发，得到所需的目标产物。
2.7色谱柱清洗。
大多数情况下，层析柱中的硅胶都是一次性使用，但是在使用后的色谱柱中，因为也有冲洗溶剂，所以要把硅胶放入水中比较难，将硅胶取出的方法之一是将硅胶放置一段时间，让溶剂自然挥发，然后倒出硅胶。但是这个方法很耗时，而且对环境有污染。另一种方法是使用比色谱柱稍长的木棒或塑料棒，把含有溶剂的硅胶一段一段地取出，但是这种方法也比较麻烦。三是使用普通真空泵，将剩下的溶剂通过色谱柱提取出来，然后在色谱柱与真空泵之间加上一个冷阱，因此，提取出的溶剂在不污染环境的情况下，可以有效地对萃取液进行萃取，同时可以快速干燥，使得硅胶易于倒出。
3.选用色谱柱。
普通柱子可分为：压力、常压、减压。
压强可提高溶剂流速，缩短产物的收集时间，但会降低塔板数量。因此在其它条件不变的情况下，常压柱是有效的，但时间还长，例如对天然化合物的分离，一个柱子可以有几个月。
①减压柱可降低硅胶用量，使人感觉能省一半或更多，但因为大量空气通过硅胶，溶剂会挥发(有时候水汽会在柱子外凝结)，还有一些更容易分解的东西可能得不到，同时也要用泵来抽气(噪音大，而且时间长)。

②压力柱法是一种较好的方法，类似于常压柱，只是由于施加压力，溶剂移动较快。可提供压缩空气、双连杆式或小气泵(为鱼缸供气)。尤其适用于分离易分解的样品。不能过高压力，否则溶剂流速过快会降低分离效果。压力柱更适合于常规有机物的分离。

③常压柱层析，常用于色谱分析。其显著优势在于，其分离效率高于经典化学分离方法，与其它色谱方法相比，对仪器和设备要求较低，替换流动相和吸附剂方便，耗材少，成本低，适用于多种不同的样品，从克至微克级范围非常宽的样品，所以，至今仍然被广泛地用于化学实验室。
4.选择溶剂。
在整个柱层色谱分离操作中，溶剂的选择可能是比较困难的，也是实验成功的关键。溶剂通常都是用简单的硅胶薄层板来筛选的。
4.1薄层板点样。
将样品溶于低沸点的有机溶剂中(例如，氯仿，丙酮，甲醇，乙醇等)，然后用毛细管或微探针。
将测试点放置在薄层板上，点样量要适宜，一般样品量少，则分离清晰，但要注意检测灵敏度。
4.2点样展开。
4.2.1选择展开剂。
用微量圆环法及小型化色谱法筛选展开剂。
①微循环法：将需要分离的物质，按常规方法点于薄板上，两点相距2-3cm，再次以毛细管吸收溶剂体系垂直放置于样点中心，让溶剂从毛细管内按中性条件流出展开；干后显色.观察斑点分离情况.背试物质为未知化物和物时，常以低极性溶剂展开，如残存点不动，但需要增加溶剂极性，或者增加洗脱液的量，如果流动太快，则必须采用极低极性的溶剂。
②小型化色谱法：用普通载薄片制取所要分离的物质，将其装入薄板，放在小玻璃缸或广口瓶内，将其展开，干燥显色，观察色斑分离。
4.2.2展开方法。
TLC的展开方法主要有上行法、下行法、双向展开法、径向展开法等：
①向上的方法：使展开剂由下向上爬。
②下降法：使扩展剂从上而下.此法可用极性较弱的展开剂。
③二向展开法：将方板像纸色谱那样双向展开。
④辐射展开法：